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枯草桿菌黑色變種芽胞懸液的制備方法!

 1、以無菌操作方式開啟菌種管,加入適量營養肉湯培養基,吹吸數次,使菌種融化分散。取含5.0 mL~10.0 mL營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置36 ±1 培養18 h~24 h。用接種環取第1代培養的菌懸液,劃線接種于營養瓊脂培養基平板上,置36 ±1 培養18 h~24 h。挑取上述第2代培養物中典型菌落,接種于營養肉湯培養基,置36 ±1 培養18 h~24 h,即為第3代培養物。

 
2、用10.0 mL吸管吸取5.0 mL~10.0 mL第3代~5代的18 h~24 h營養肉湯培養物,接種于羅氏瓶(或細胞培養瓶)營養瓊脂培養基表面,將其搖動使菌液布滿培養基表面,將多余肉湯培養物吸出,羅氏瓶(或細胞培養瓶)置36 ±1 恒溫培養箱內培養5 d~7 d。
 
3、用接種環取少許菌苔涂于玻片上,以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法:用接種環取菌苔涂于玻片上,自然干燥后,通過火焰加熱將菌固定于玻片上;將涂片放入平皿內,片上放兩層濾紙,滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液,將平皿蓋好,置55 ±1 加熱30 min。取出,去濾紙,用自來水沖去殘留液;加0.5%沙黃水溶液,1 min后水洗,待干后鏡檢。芽胞呈綠色,菌體呈紅色。在顯微鏡(油鏡)下鏡檢,當芽胞形成率達90%以上時,即可進行以下處理。否則,繼續在室溫下放置一定時間,直至達到上述芽胞形成率后再進行以下處理。
 
4、加10.0 mL無菌蒸餾水于羅氏瓶(或細胞培養瓶)中,以L棒輕輕刮下菌苔,吸出,再加入5.0 mL無菌蒸餾水沖洗培養基表面,吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中,振搖5 min。
 
5、將燒瓶置45 水浴24 h,使菌自溶斷鏈,分散成單個芽胞。
 
6、用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液,清除瓊脂凝塊。
 
7、將芽胞懸液置無菌離心管內,以3000 r/min速度離心30 min。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗,本步驟重復進行3遍。
 
8、將洗凈的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內,80 水浴10 min(或60 水浴30 min),以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后,搖勻分裝后冷藏保存備用,有效使用期6個月。
 
9、芽胞懸液在使用時,先進行活菌培養計數。
 
10、懷疑有污染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑒定。
 
本文節選自中華人民共和國衛生行業標準《WS/T 683—2020消毒試驗用微生物要求》。
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