肉毒梭菌菌落形態：類圓形，邊緣不整，直徑大約3毫米。菌落突出平板表面，灰白色，表面一般比較光滑也有的呈顆粒狀，菌落底部及周圍形成甘油二酯的沉淀乳濁環。如果平板表面濕潤則菌落界線不明顯，向外擴散，常常擴散成菌苔。也可形成絨毛網狀菌落。血瓊脂平板，血液具有降低氧化還原電位的作用，能促進肉毒梭菌的生長。菌落周圍出現大而透明的溶血環（除G型） 。
最嚴格的厭氧菌 ：常溫催化除氧式或焦性沒石子酸除氧式。
生長最適溫度：28 ～37 酸堿度：pH為6.8—7.6，產毒的最適pH為7.8 ~8.2
產毒培養溫度：各型菌產毒的最適培養溫度不完全相同。C、D型溫度高些為宜，35 培養3d即可，而E型菌低溫度長時間培養效果較好， 25 培養7~10d。為兼顧其它型，統一采用30培養 5 ~10d ， pH7.8 。
菌株分離培養溫度：35 48h ， pH為7.5 。
對營養要求不高 ：在普通培養基上都能生長。
增菌產毒培養基：即適于肉毒梭菌發芽、繁殖，又適于產生毒素（庖肉培養基）。呈均勻混蝕生長，肉渣可被A、B和F型菌消化，并發黑，產生腐敗惡臭味，產生大量氣體。
分離鑒定培養基：卵黃瓊脂平板是較好的培養基，由于肉毒梭菌（除G型）產生脂肪酶，分解卵黃中的脂肪，在卵黃瓊脂平板上形成的菌落及其周圍培養基表面在斜光照射下可見到虹彩薄層，此現象，除A型諾氏梭菌及生孢梭菌外，屬于肉毒梭菌所特有，有一定的鑒別作用。
