人永生化表皮細胞(HaCat)介紹：人永生化表皮細胞(HaCat)源自一位62 歲患有黑色素瘤男性的病灶外圍正常皮膚，角蛋白、角化細胞交聯(lián)外膜蛋白、中間絲相關蛋白陽性。

人永生化表皮細胞(HaCat)特性

1） 來源：正常表皮細胞

2） 形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x106 個/mL

4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運輸和保存：使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml 凍存管發(fā)送存活細胞。收到細胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min 后，于潔凈操作臺棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉移至10cm 培養(yǎng)皿或者T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

人永生化表皮細胞(HaCat)用途：僅供科研使用。

人永生化表皮細胞(HaCat)培養(yǎng)步驟：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM 培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，85%；北美胎牛血清(United States，GIBCO，貨號16000-044)，15%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二．細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL 細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm 皿中，加入約8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤洗細胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml 含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO 后進行凍存。

注意事項：

1. 收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。