永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）介紹：永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）是人微血管內皮細胞通過含端粒酶逆轉錄SV40T慢病毒轉染得到。
1） 來源：人腦微血管
2） 形態：細胞呈梭狀，細長型
3） 含量：>1x106 個/mL
4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性
5） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
運輸和保存
可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式
（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復蘇；
（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。
（3）收到細胞后請拍照，3天內如果發現污染，請及時拍照與我們聯系。
永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）用途：僅供科研使用。
細胞接收后的處理：
1） 收到細胞后，請檢查發貨培養瓶的狀況，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。
2） 在顯微鏡下確認細胞生長狀態時，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度。看細胞的形態請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態的依據。
3） 觀察好細胞狀態后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h。
4） 貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現象，如發現貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基的原培養瓶中（或新的培養瓶中）。
5） 懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養瓶中（加入按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基）。
6）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。 收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代 。
一．永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）培養基及培養凍存條件準備：
1）準備內皮細胞完全培養體系（簡稱：ECM) 規格：500ml
2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。
1） 凍存細胞：凍存細胞時，用FBS重懸細胞，然后加入一定量的DMSO，輕輕混合均勻后移入到凍存管中，DMSO終濃度為10%。
二．細胞處理：
1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養瓶中培養，補加培養基至6ml。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml此細胞的培養基終止消化。
3. 輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養液后吹勻。
4 . 收到細胞后首次傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續傳代根據實際情況按1:2到1:4的比例進行。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1，細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗一遍后加入1-2ml胰酶（含EDTA），細胞變圓脫落后，加入2-3ml含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。
2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和等體積的凍存液，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x10E6/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
